Использование ооцитов КРС для получения доимплонтированных эмбрионов в системе in vitro с их последующей пересадкой, современный и востребованный метод. До недавнего времени основным источником ооцитов как правило служили яичники убойных коров и тёлок. Использование убойного материала значительно ограничивало возможности в получении ооцитов от ценных доноров для биотехнологических программ по воспроизводству. Однако благодаря созданию систем оборудования для прижизненного забора ооцитов появились возможности многократного получения гамет от одного донора.
Впервые трансвагинальная аспирация ооцитов (ТАО), по международной классификации OPU (Ovum Pick-Up), у крупного рогатого скота была проведена командой датских исследователей во главе с Callesen H. в 1987 г., по результатам которой после пункции 38 фолликулов у 7 су- перовулировавших (стимулированных на суперовуляцию) телок было получено 16 ооцитов.
Технически процедура выглядит следующим образом. Держатель зонда с ультразвуковым датчиком помещают во влагалище и располагают перед шейкой матки. Ультразвуковой датчик обеспечивает визуализацию яичника и расположенных в корковом слое фолликулов. Далее одну руку вводят в прямую кишку животного и манипулируют яичником относительно передней части влагалища в непосредственной близости от шейки матки. Другой рукой в вагину продвигают держатель зонда, и по мере выдвижения иглы вперед она проводится через стенку влагалища и направляется в фолликулы. Извлечённая фолликулярная жидкость, содержащая ооциты, по системе шлангов направляется и накапливается в подогреваемой ёмкости.
Стоит отметить, что получение ооцитов методом трансвагинальной аспирации способствует не только более эффективному использованию животных, имеющих ценное хозяйственное значение, но и даёт возможность получения большого числа компетентных ооцитов с одинаковым физиологическим статусом. Что в последующем определяет успех метода.
Собственные исследования
Методы исследования
Серия производственных опытов проводилась на донорском стаде центра по трансплантации эмбрионов ООО «Бетагран – Липецк» и делилась на несколько этапов. Пункцию фолликулов проводили с использованием ультразвуковой системы AlokaSSD 500, включающей в себя ультразвуковой сканер Aloka Prosound 2, ультразвуковой излучатель с частотой 89 MHz, вакуумную помпу Craft suction unit, держатель ультразвукового излучателя, иглы длиной 55 см и диметром 18G. Скорость аспирации фолликулярной жидкости составляла 25 мл/мин. В качестве промывной жидкости использовали фосфатно солевой буфер Дюльбекко с добавлением 100 ед/мл гентамицина и 0,5 % эстральной сыворотки. Локализацию ооцит-кумулюсных комплексов проводили с помощью фильтровальной системы EmSafe для вымывания КРС и лошадей. Поиск и оценку качества полученных ооцитов осуществляли под лабораторной стереоскопической бинокулярной лупой Olympus sz 51 при 16- и 90-кратным увеличении. Пригодные ооциты делили на 4 категории. А-отличные, B-хорошие рис.1, С-удовлетворительные, рис.2, D-условно годные рис 3.
Влияние донора на количество извлекаемых ооцитов остаётся по-прежнему дискуссионной темой и требует изучения. Для этого были отобраны 22 головы коров голштинской породы, от каждого животного были получены ооцит–кумулюсные комплексы. Количество аспираций на донора составило от 7 до 15 процедур. Таким образом получено всего 1335 ооцитов. Из них отличных и хороших 265 шт., количество ооцитов удовлетворительных и условно годных составило 649 шт. Всего пригодных получено 914 шт. или 68,46 % от числа извлечённых. Показатели выхода ооцитов отражены в таблице 1.
Можно сделать вывод, что количество, а также выход пригодных ооцитов является величиной не одинаковой и зависит от индивидуальных особенностей донора.
Возможность получения большего числа ооцитов за одну аспирацию, а также сокращение интервала между ними имеют важное практическое значение. Проведение пункций по забору ооцитов с интервалом два раза в неделю отмечено и в работах ряда зарубежных исследователей. Согласно опытам, проведённым R. Boni сравнение этих двух подходов к получению ооцит – кумулюсных комплексов подтвердило, что двукратная аспирация повышала как выход ооцитов, так и выход качественных эмбрионов. P. Bols, так же отмечает повышение качества ооцитов при 2-х кратной аспирации. Предполагая, что это связано по всей видимости, с тем, что 2-х кратная в неделю аспирация стимулирует и синхронизирует новые волны роста фолликулов.
Для этого были отобраны 22 головы коров доноров и разделены на две опытные группы по 11 голов в каждой. Результаты опытов отражены в таблице 2. Пункция фолликулов проводилась с интервалом в 3 и 7 дней на протяжении 18 месяцев. За этот период была осуществлена 291аспирация донорского стада. Было получено всего ооцитов 1386 шт., из них отличных/хороших 273 шт., удовлетворительных/условно годных 664 шт., всего непригодных 442 шт.
Изучение влияния кратности аспираций на выход и качество гамет показало, что у 11 доноров семи дневной группы за 180 процедур количество пригодных ооцитов составило 570 шт., что равняется 67% от числа полученных. Суммарный выход ооцитов на одну аспирацию составил 4,6 от числа полученных. Выход пригодных ооцитов равнялся 3,1 на донора.
Во втором случае от 11 доноров трёхдневной группы за 111 процедур количество пригодных ооцитов составило 303 шт., что равняется 56% от числа полученных. Или же на 11 % меньше по сравнению с первой группой. Суммарный выход ооцитов на одну аспирацию составил 4,8 от числа полученных, что на 0,2 больше по сравнению с первой группой. Выход пригодных ооцитов равнялся 2,7 на донора, что на 0,4 меньше по сравнению с первой группой.
Схожие данные были получены и при использовании этих двух подходов (через три и семь дней) на одних и тех же донорах. Что отражено в таблице 3. Для опыта были отобраны 8 доноров. Всего проведено 77 аспираций. Получено ооцитов всего 452 шт., из них пригодных 325 шт., что составило 71,90% от числа полученных. Количество ооцитов на одну аспирацию составило всего 5,8 выход пригодных 4,2.
На этих же донорах при однократной аспирации проведено 97 процедур. Получено ооцитов всего 623 шт., всего пригодных 445 шт., что составило 71,14% от числа полученных. Общее количество полученных ооцитов на донора было на 0,6 больше по сравнению с первой группой и составило 6,4. Количество пригодных было на 0,3 больше по сравнению с первой группой и составило 4,5 на донора.
Как видно из результатов таблиц, влияние частоты аспирации на ее эффективность в разрезе доноров также не показало значительных различий. Таким образом стоит обратить внимание, что за счёт укороченного интервала при двух кратной аспирации, разница в количестве и качестве будет компенсироваться за счет частоты получения ооцит кумулюсные комплексов, что позволит более эффективно использовать животное.
Производственное долголетие донора имеет важное значение. Микротравмы влагалища и коркового слоя яичника которые образуются вследствие проколов могут негативно сказываться на здоровье репродуктивного тракта животного. Для этой цели нами был проанализирован широкий спектр информации о который отражал два показателя. Первое это суммарное количество аспираций за всё время использования донора и второе это изменение качества и количества ооцитов за всё время работы с донором.
Для анализа были использованы данные о 27 донорах которые аспирировались от 1-10.0 до 50.0 и более 50.0 раз. В сумме за этот период было получено всего 4115 ооцитов. Из них 2836 пригодных, что составило 68,91% от количества полученных. Как видно из данных таблицы 4 выход пригодных от числа полученных в промежутке от 1 до 50 аспираций не имел значительных отклонений в худшую сторону и оставался практически на одном и том же уровне. И в среднем составил 75,00%. В тоже время данные по пяти донорам аспирированных более 50-ти раз показывают снижение числа пригодных ооцитов до 62,80%, а вот количество непригодных ооцитов значительно возрастало и в некоторых случаях составило уже 59,00% от числа полученных.
На рис. 5, 6 и 7 визуально отражена динамика получения ооцитов у коров доноров. При этом количество аспираций донора составляет от 83 до 95. Примечателен тот факт, что на момент подведения статистики эти доноры находились в стаде и использовали для получения ооцитов. На сегодняшний день разрабатывается методика восстановления репродуктивной системы донора после многочисленных аспираций.
Выводы: Согласно результатам опытов количество пригодных ооцитов, получаемых от доноров единица не постоянная и сугубо индивидуальная. В нашем случае эта цифра колебалась от 0,9 до 5,4 ооцита на донора. Возможно получение жизнеспособных ооцитов при проведении пункции фолликулов с интервалом раз в три дня. Использование доноров в среднем до 50 раз не значительно влияло на выход и качество получаемых ооцитов. Увеличение количества аспираций свыше 50-ти и до 100 снижало выход жизнеспособных ооцитов с 75.00% до 62.80% и увеличивало выход непригодных с 24,60 % до 59,0%.
Старший эмбриолог, кандидат сельскохозяйственных наук Машталер Д.В.
Доктор сельскохозяйственных наук Голубец Л.В.
Кандидат сельскохозяйственных наук Дешко А.С.
Главный биотехнолог Хромов Н.И.
